Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.metode ini dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). KCKT adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif. Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu: 1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution) Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k’ (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya. 2. Sistem elusi gradient (gradient elution) Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k’ akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi sepanjang kolom secara cepat sampai ia keluar dari kolom. Persamaan elusi gradient : Waktu retensi = tg =tMk log (2,3 ko/k) Resolusi = Rs =[(1/4)(α-1)N1/2] [k/1+ k] Lebar pita = =1/2[VM(1+k)N1/2] Dimana : Ko = nilai k’ pada awal pemisahan tg = waktu retensi pada elusi gradien g = lebar pita gradien tM = waktu transit zat yang ditahan α = retensi relatif VM = volume gerak N = jumlah pelat (kromotof) Nilai k selama migrasi harus berkisar pada rentang 1<10. Pada saat keluar kolom, k menjadi (~1). Nilai k kecil pada saat elusi menghasilkan pita tajam dan berarti sensitifitasnya tinggi. 3. Sistem elusi bertahap Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap diganti. Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain : a. Temperatur b. Tekanan c. Diameter partikel fase diam d. Viskositas e. Panjang kolom Beberapa jenis teknik pemisahan dalam KCKT telah dikembangkan berdasarkan jenis fase diam dan fase geraknya: a. Kromatografi adsorpsi Fase diam yang biasa digunakan adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau alumina hidrat. Fase mobil berkompetisi terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fase diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan tertahan lebih lama di dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel. b. Kromatografi partisi Linarut dibagi atas fase gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada suatu patikel padat sebagai fase diam. Fase diam dapat berupa fase diam yang disalutkan pada partikel penyangga. Kolom fase terikat (bonded-fase colum) merupakan kolom yang paling umum digunakan. c. Kromatografi penukar ion Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fase gerak dan fase diam pada lokasi penukaran ion. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda.